早期胚胎發(fā)育是生命科學(xué)領(lǐng)域的核心研究方向之一。胚胎從受精卵開(kāi)始發(fā)育，經(jīng)過(guò)基因組激活(zygotic genome activation, ZGA)、快速細(xì)胞分裂和譜系分化，最終形成囊胚，為胚胎著床及后續(xù)發(fā)育奠定基礎(chǔ)。在這一過(guò)程中，囊胚內(nèi)三譜系的形成——內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass, ICM)、原始內(nèi)胚層(primitive endoderm, PrE)和滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm, TE)——標(biāo)志著胚胎命運(yùn)決定的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)。然而，受限于胚胎樣本的稀缺性和實(shí)驗(yàn)條件的限制，如何構(gòu)建精準(zhǔn)模擬早期胚胎發(fā)育的體外系統(tǒng)，仍是該領(lǐng)域亟待解決的科學(xué)難題。
2021年，北京大學(xué)杜鵬教授課題組通過(guò)抑制剪接體，首次捕獲并穩(wěn)定培養(yǎng)了小鼠全能性干細(xì)胞(mouse totipotent blastomere-like cells,mTBLCs)(Shen et al.,2021)。與經(jīng)典的多能性干細(xì)胞不同，mTBLCs能夠重現(xiàn)全能性卵裂球的特征，為構(gòu)建從單細(xì)胞開(kāi)始的分化和囊胚形成模型提供了理想的“種子細(xì)胞”。隨后，在2024年，研究團(tuán)隊(duì)利用相同的策略成功獲得了人的全能性干細(xì)胞(Li et al., 2024)，為進(jìn)一步探索全能性及其胚胎發(fā)育研究中的應(yīng)用提供了重要工具。
基于mTBLCs的這一特性，2025年1月17日，杜鵬課題組在Cell Stem Cell雜志在線發(fā)表了題為“Mouse totipotent blastomere-like cells model embryogenesis from zygotic genome activation to post implantation”的研究論文。在這項(xiàng)研究中，作者進(jìn)一步優(yōu)化了mTBLCs培養(yǎng)條件，并開(kāi)發(fā)了mTBLCs自發(fā)分化和單細(xì)胞起始的類囊胚形成系統(tǒng)，mTBLCs-類囊胚具有EPI、PrE和TE譜系，并能進(jìn)一步形成著床后階段的卵圓柱胚樣結(jié)構(gòu)，重現(xiàn)了從ZGA至囊胚形成的完整發(fā)育過(guò)程。這一突破為研究全能性、細(xì)胞命運(yùn)決定以及早期胚胎形態(tài)發(fā)生提供了新的技術(shù)平臺(tái)，也為早期發(fā)育的基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化研究開(kāi)辟了新的可能性。
論文截圖
圖1. 通過(guò)mTBLCs模擬小鼠早期胚胎發(fā)育的關(guān)鍵事件的模式圖
在本研究工作中，作者主要有以下發(fā)現(xiàn)：
1:該研究通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基(2MYCP)，顯著提高了mTBLCs的增殖速度和長(zhǎng)期自我更新能力，主要通過(guò)加入2-DG、Minocycline、Y-27632、CHIR-99021和PlaB等因子。在此過(guò)程中，PlaB發(fā)揮了關(guān)鍵作用，通過(guò)抑制剪接驅(qū)動(dòng)了從多能性向全能性的轉(zhuǎn)變，而Oct4基因的去除并未影響mTBLCs在2MYCP培養(yǎng)基中的自我更新能力，表明Oct4不是維持細(xì)胞全能性的必要條件。2MYCP培養(yǎng)基中，Wnt信號(hào)通路在mTBLCs中被激活，且Wnt信號(hào)通路與細(xì)胞周期、增殖通路的激活與mTBLCs的快速自我更新能力密切相關(guān)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制Wnt信號(hào)通路可顯著抑制mTBLCs的增殖，證明Wnt信號(hào)對(duì)于2MYCP培養(yǎng)基中mTBLCs的快速擴(kuò)增至關(guān)重要，但它并不參與維持mTBLCs的全能性。
圖2. Wnt信號(hào)的激活促進(jìn)了mTBLCs的快速擴(kuò)增
2. mTBLCs具有獨(dú)特的表觀基因組特征，這些特征有助于其全能性維持和快速自我更新。通過(guò)ATAC-seq和CUT&Tag分析，發(fā)現(xiàn)mTBLCs的啟動(dòng)子區(qū)域(TSS)H3K27me3和H3K9me3整體水平下降，而H3K4me3、H3K27ac和RNA Pol II標(biāo)記整體水平未發(fā)生顯著變化，其表觀特征與早期胚胎的初期胚胎細(xì)胞(如2細(xì)胞階段)相似。此外，mTBLCs具有比PSCs更多的寬的H3K4me3域 (broad domain)，以及更少的二價(jià)修飾基因(bivalent gene)，且MERVL轉(zhuǎn)座子在mTBLCs中具有顯著的H3K4me3標(biāo)記。Wnt信號(hào)通路的激活進(jìn)一步增強(qiáng)了與細(xì)胞周期和增殖相關(guān)基因的H3K4me3富集，從而促進(jìn)了mTBLCs的快速增殖。
圖3. mTBLCs具有類似早期卵裂球的特定表觀特征
3.本研究進(jìn)一步評(píng)估了mTBLCs在體內(nèi)外的分化潛力。在嵌合體實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)單細(xì)胞數(shù)據(jù)，捕獲到了EGFP標(biāo)記的mTBLCs生成的13種細(xì)胞，其中包括7個(gè)胚外譜系和6個(gè)胚內(nèi)譜系，證明了其在嵌合小鼠中的雙向發(fā)育潛能。此外，mTBLCs通過(guò)類胚體(EBs)和畸胎瘤實(shí)驗(yàn)也都展示出了胚內(nèi)外雙向分化潛能，產(chǎn)生了包括神經(jīng)、心臟和腎臟等三胚層來(lái)源的細(xì)胞，也激活了包括經(jīng)典滋養(yǎng)層標(biāo)志基因，展示其能夠生成胚外滋養(yǎng)層樣譜系?？傮w而言，mTBLCs具有強(qiáng)大的雙向發(fā)育潛力，能夠分化為各種胚內(nèi)外譜系，成為評(píng)估全能干細(xì)胞發(fā)育潛力的重要工具。
圖4. mTBLCs具有強(qiáng)大的胚內(nèi)外雙向分化潛能
4.本研究利用mTBLCs建立了一個(gè)模擬胚胎著床前發(fā)育的體外分化模型，以克服現(xiàn)有體外分化系統(tǒng)的挑戰(zhàn)。在基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)mTBLCs約3-4天后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，形成了胚胎干細(xì)胞(ESC)、胚外內(nèi)胚層干細(xì)胞(XEN)和滋養(yǎng)層干細(xì)胞(TSC)樣的克隆。RNA-seq分析顯示，mTBLCs在分化過(guò)程中激活了不同發(fā)育階段的基因，經(jīng)歷了從早期初級(jí)基因組激活(minor ZGA)到主要基因激活(major ZGA)的轉(zhuǎn)變。免疫組化驗(yàn)證了mTBLCs能夠分化為上胚層(EPI)、胚外滋養(yǎng)層(TE)和原始內(nèi)胚層(PrE)等譜系。單細(xì)胞RNA測(cè)序揭示，mTBLCs在分化過(guò)程中產(chǎn)生了涵蓋2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞及囊胚階段的多種細(xì)胞類型，擬時(shí)間分析顯示mTBLCs經(jīng)歷了兩次命運(yùn)決定，首次產(chǎn)生TE樣細(xì)胞和ICM/EPI樣細(xì)胞，隨后ICM/EPI樣細(xì)胞分化產(chǎn)生了PrE樣細(xì)胞。
研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在自發(fā)分化過(guò)程中，mTBLCs還產(chǎn)生了Zscan4+和Zscan4-兩類基因組激活樣細(xì)胞(ZLCs)。擬時(shí)間分析表明，只有Zscan4- ZLCs能夠成功分化為EPI、PrE和TE三大譜系。因此，本研究提出，主要的 ZGA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能至少可以分為由Zscan4表達(dá)標(biāo)記的兩個(gè)獨(dú)立部分。同時(shí)，Zscan4的表達(dá)可能并不是進(jìn)一步干細(xì)胞命運(yùn)決定所必需的。這一觀察結(jié)果也與人類TBLC的自發(fā)分化過(guò)程一致，在這一過(guò)程中，經(jīng)典的ZGA標(biāo)志基因(如ZSCAN4/5A、DUXA/B和TPRX1等)完全沒(méi)有被誘導(dǎo)表達(dá)(Li et al., 2024)。這些發(fā)現(xiàn)不僅進(jìn)一步證實(shí)了mTBLCs的內(nèi)在全能性，也為探索哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中的共性機(jī)制提供了新視角。
圖5. mTBLCs自由分化體系模擬著床前胚胎發(fā)育
5. 此外，本研究發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有任何外源性信號(hào)干預(yù)的情況下，單個(gè)mTBLC能夠經(jīng)歷擴(kuò)增、極化和壓實(shí)過(guò)程，最終高效率的形成結(jié)構(gòu)完整的類囊胚(blastoid)。這一類囊胚結(jié)構(gòu)不僅包含內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、原始內(nèi)胚層和滋養(yǎng)外胚層等胚胎樣細(xì)胞，且未見(jiàn)異常中間狀態(tài)的細(xì)胞，mTBLC來(lái)源的囊胚在轉(zhuǎn)錄組上與體內(nèi)囊胚更為接近，三個(gè)譜系的特定標(biāo)志物富集。并且類囊胚可以在體外繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)育成類似卵圓柱的后植入階段結(jié)構(gòu)。也可以將類囊胚移植到假孕小鼠中，其成功植入并形成卵圓柱樣著床后胚胎結(jié)構(gòu)。
圖6. mTBLCs生成類囊胚并進(jìn)一步發(fā)育成著床后卵圓柱樣胚胎
綜上，本研究首次建立了基于mTBLC的自發(fā)分化和胚胎樣結(jié)構(gòu)形成系統(tǒng)，成功模擬了胚胎早期發(fā)育的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。尤其是在細(xì)胞命運(yùn)決定和全能性研究領(lǐng)域，這一系統(tǒng)為理解早期胚胎發(fā)育中的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變提供了新的視角。此外，該研究還為胚胎發(fā)育模型的應(yīng)用開(kāi)辟了新的可能性，未來(lái)基于這一系統(tǒng)，科學(xué)家們有望深入研究胚胎發(fā)育異常的分子機(jī)制，探索病理過(guò)程，甚至為解決不孕不育等生育醫(yī)學(xué)問(wèn)題提供全新解決方案。
杜鵬為該論文的通訊作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后彭冰、北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院博士研究生王清儀、生命科學(xué)學(xué)院博士研究生張飛翔為本文的并列第一作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后申輝參與了部分工作。該項(xiàng)工作得到了北京高等學(xué)校卓越青年科學(xué)家計(jì)劃、北京市自然科學(xué)基金、國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃基金的支持。
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原文鏈接：
Li, S., Yang, M., Shen, H., Ding, L., Lyu, X., Lin, K., Ong, J., and Du, P. (2024). Capturing totipotency in human cells through spliceosomal repression. Cell 187, 3284-3302.e23.
Shen, H., Yang, M., Li, S., Zhang, J., Peng, B., Wang, C., Chang, Z., Ong, J., and Du, P. (2021). Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression. Cell
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